将生物安全性检测拓展到基因治疗产品
基因治疗产品引发的许多生物安全性挑战涉及腺相关病毒(AAV)载体等载体。虽然AAV载体已被通常性用于临床前动物研究和临床试验，但它们仍然存在风险，这些风险难以用传统的测试方法评估。幸运的是，新的检测方法正在开发中，它们适用于AAV载体和其它病毒载体的生产。此外，正在开发与多种载体生产工艺兼容的病毒灭活和去除技术。
在生物安全检测中，我想到了“dot your i’s and cross your t’s”（在字母 i上面点上点儿，字母 t 上画上横，意思是注意细节，做事完善）这句话。要是生物安全检测能这么简单就好了。但事实并非如此。是的，生物安全检测确实要求我们关注既定任务的细节，比如确保治疗性抗体和重组蛋白的质量。但是生物安全检测还必须处理相对较新的、定义不明确的任务，这些任务涉及基因疗法和细胞疗法的生产。这就像是在使用一个不断添加新字母的字母表。
鉴于重组腺相关病毒(rAAV)载体等生物药产品的出现，生物安全检测必须既细致又创新。新产品带来了新挑战，因此有必要考虑新的解决方案。
在最近的两次会议上讨论了生物安全挑战和可能的解决方案。本文将介绍这些会议的宝贵见解，其中包括在生物工艺国际会议(去年9月举行)或生物工艺峰会(去年8月举行)上发言的科学家的评论。
本文中引用的科学家涉及一系列主题：可应用于多种载体生产过程的强大病毒灭活和/或去除技术；应用2D高效液相色谱(2D-HPLC)改进对工艺产量和关键质量属性的监控；质量源于设计方法可以帮助开发人员克服化学、制造和控制(CMC)文件的缺陷；正交法在宿主细胞蛋白检测中的应用；以及使用无细胞克隆技术来避免与定义不清的细胞裂解物相关的复杂性。
rAAV载体的生物安全策略
对于治疗性抗体和重组蛋白来说，生物安全性是相当直接的。但对于rAAV载体则不是这样。Avirmax公司首席执行官Shengjiang (Shawn) Liu博士指出:“生物药的生产系统、细胞底物和收获技术已经研究了20多年，治疗性抗体和重组蛋白已经积累了大量的工艺数据和知识。”Avirmax正在研究基于Bac-to-AAV技术的AAV-载体-介导的生物治疗药物。
Avirmax使用Bac-to-AAV和Sf9细胞培养技术开发和生产腺相关病毒(AAV)载体介导的生物治疗药物。该公司表示，与使用人类或其它哺乳动物细胞培养系统生产的产品相比，Sf9细胞培养为基因治疗产品提供了更高的病原体安全保证。然而，该公司强调，不同的载体类型将需要不同的生物安全策略。任何给定的策略都反映了一种独特的现实、技术和生产方面的考虑。
“这些生物制品的生物安全状况更加可预测和管理，”他继续说。“然而，就必要的技术和积累的经验而言，实现基因治疗载体生产的全面生物安全性还处于起步阶段。”
Liu说，生物安全方法将根据载体的生物功能而有所不同:“囊膜病毒载体(例如慢病毒载体)和非囊膜病毒载体(例如rAAV载体)彼此之间有很大的不同，而且这些载体类型也有非常不同的生物物理和生化特性。因此，在获得生物安全方面使用的策略和方法应该得到不同的考虑。”
他解释说:“最大的挑战之一是开发适用于多种载体生产过程的合适、有效且强大的病毒灭活或去除技术。”例如，公司必须降低病原体潜在传播的风险，如内源性病毒样颗粒、外来物质和/或可传播海绵状脑病，这些病原体可能因在载体生产中使用人源细胞底物而引入。
Liu乐观地认为，该行业将解决其挑战:“自从第一个重组蛋白被批准用于人类使用以来，还没有单个病例因使用重组技术生产的治疗性产品而导致病毒感染/传播。我相信基因治疗载体的生产也将如此。”
用于前期开发的2D HPLC
在基于AAV的药物的下游工艺过程中，监控工艺产量和关键产品质量属性可以提供有用的安全信息。“AAV药物底物中空衣壳的数量可以影响产品的效力，并引发免疫反应，”Biogen基因治疗工艺开发团队高级工程师Xiaotong Fu博士说。“在工艺开发过程中监测空衣壳的比例，使我们能够生产出纯度一致、安全性一致的药物底物。”
Fu报告说，Biogen之所以专注于2D-HPLC方法，是因为它提供了多方面的优势：“2D-HPLC方法……被质量控制团队和监管机构广泛接受。它是自动化的，具有更高的通量，而其它方法可能会与手动操作或低通量‘斗争’。此外，它消耗更少的物料，使AAV样品分析更具成本效益，可以在需要时进行更广泛的检测。”
Biogen的2D-HPLC方法使用两柱工艺从粗样品中纯化AAV。它对纯化的AAV进行紫外吸收检测，并将其转换为滴度和空/完整信息。“这种方法与基因治疗领域建立的其它正交方法一致，”Fu断言。“它为我们提供了一个选择，以高通量、自动化和具有良好成本效益的方式跟踪AAV滴度和空/完整百分比。这意味着我们可以从早期开发阶段就更好地评估产品质量，包括生物安全性。”
Fu还指出，2D-HPLC方法可以通过快速在线检测实现对上游和下游工艺的过程监测，而无需消耗纯化和分析支持资源。Biogen将继续改进这种方法，以获得更好的准确性和稳健性。
Fu认为，在未来，制药行业需要更多的新方法来解决生物安全问题。他指出:“目前，鉴定AAV产品生物安全性的选择仍然有限，尤其是那些可以加快鉴定过程并提高成本效率的选择。我鼓励该领域继续致力于基因治疗产品的创新方法，从长远来看，这将有利于基因治疗领域和患者。”
QbD的力量
2020年，FDA拒绝了几种基因治疗产品的生物制品许可申请，因为它们提供的化学、制造和控制(CMC)信息太少。Pall的团队经理Parth Trivedi说:“准备不充分的CMC是公司获得新基因治疗候选药物监管批准的最大障碍之一。”
Trivedi和他的团队成员建议，适当的CMC文件的一个关键方面是质量源于设计(QbD)原则的应用。Trivedi强调:“QbD依赖于工艺设计，而不仅仅是最终的质量检测，并从一开始就专注于实现安全性和有效性。通常，这类信息在很大程度上基于先前的知识。然而，对于基因治疗产品，经验仍然非常有限，使得制造商很难利用积累的知识。”
为了解决这个知识鸿沟，Pall提供了一个专门针对AAV平台设计的模板。Trivedi解释说：“QbD方法首先定义质量目标生产概况，总结药品的安全性、纯度和有效性规格。此分析将识别并强调关键质量属性(CQA)。为了确保满足这些CQA，还需要两个过程：一组关键工艺参数的鉴别，以及关键材料属性的定义。”
Trivedi注意到，Pall已经准备了一份白皮书(“QbD for AAV”)，描述了基于QbD的AAV参考工艺框架，并将其应用于四种最常见的上游生产方法:1)转染贴壁人胚胎肾(HEK)细胞；2)转染悬浮HEK细胞；3)杆状病毒感染Sf9悬浮细胞；4)腺病毒感染HeLa生产细胞。
“我们关注的是对患者安全性的影响，并确定了AAV平台的14个CQA，”Trivedi报告说。“我们结合了文献、行业和内部数据，以及我们公司主题专家的知识。”
根据Trivedi的说法，得出的结论很简单:“我们已经表明，尽管AAV在生物制药生产中的应用还很新鲜，但业界已经建立了广泛的工艺理解。今后，最好的建议是咨询该领域的专家。”
针对HCP的新视角
残留的宿主细胞蛋白(HCP) - 不可避免地会污染生物制药产品的蛋白质 - 代表了基因治疗产品生产中CQA生物安全监测的一个方面。AAV载体通常在人类细胞系中生产，如HEK293。这种方法导致了一个复杂的蛋白质组学背景。此外，收获病毒载体涉及细胞裂解，可能会增加HCP的负载。
Charles River Laboratories生物检测科学顾问Andrew Hanneman博士说，病毒载体生产中下游纯化步骤的数量有限，可能会降低将载体从背景HCP杂质中分离出来的能力。这一问题可能在基因治疗项目中加剧，这些项目旨在治疗严重的适应症，因此更有可能以加快的速度进行。当面临时间限制时，公司可能会选择在生物安全性分析中放弃产品特异性免疫分析。也就是说，开发这种检测方法所需要的时间似乎太宝贵了。Hanneman建议，另一种针对产品安全的方法是依靠质谱法。
他指出:“传统的产品特异性ELISA开发使用过程匹配的宿主细胞蛋白抗原(空或模拟材料)来支持III期临床批次的生产是耗时的，需要大量的物料。因此，AAV公司经常依赖于通用的HCP试剂盒。然而，ELISA试剂盒可能不能提供可靠的HCP覆盖率来检测所有的危险蛋白。依靠基于试剂盒的ELISA结果，而没有支持性数据来了解试剂盒的HCP覆盖率代表了安全性和合规风险。”
Hanneman提出的解决方案是使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)实现无标签量化(LFQ)工作流来鉴别和量化HCP。他指出，这种方法代表了ELISA的无偏正交方法，也提供了一种鉴别单个蛋白质污染物的方法。他补充说，“一种相关的基于MS的定量方法可以对任何鉴别出的高风险蛋白质使用肽标准品，这些肽标准品以确定的浓度添加到样品中，以提供目标HCP含量的绝对定量读数。”
这些方法也可以与ELISA覆盖方法相结合。他解释说，“传统的2D凝胶western blot覆盖的ELISA试剂盒是有用的，使用免疫沉淀和LC-MS/MS来确定哪些蛋白被ELISA试剂识别或不被识别的新方法也是有用的。” 在这些方法中，可以使用基于试剂盒的或特定于工艺的试剂。
可避免问题的克隆工艺
无论采用何种基因治疗平台，原材料的输入都对后续的生物安全性有着重要的影响。据OriCiro Genomics首席技术官Nasir Bashiruddin博士说，一种新的策略是利用无细胞克隆技术。OriCiro开发了一种这样的技术。他说:“由于我们的技术不需要细胞，所以在生产过程中不需要抗生素及其相应的耐药性基因。此外，我们的无细胞克隆系统是完全由纯化蛋白质重组而成的，因此不包含内毒素或宿主细胞DNA和RNA。”
Bashiruddin认为，无细胞系统有很多优势:“用我们的系统进行质粒DNA的生产具有高度可放大性，因此从早期研究到GMP水平将只需要更少的准备时间，但不需要创建主细胞库。能够规避主细胞库的需要，也消除了对质粒丢失、拷贝数和超螺旋DNA内容物的担忧。一旦质粒DNA合成，下游的纯化也非常简单和快速，因为它是一个完全确定的系统，不像细胞裂解液。最后，我们的主要合成产物是超螺旋DNA，这是下游生产最理想的形式。”
随着各家公司在基因治疗产品上取得长足进步，在严格的生物安全性检测方面也必须取得同步进展，强调打破常规思维的必要性，以及利用传统技术的非传统用途。
原文：K. Liszewski, Extending Biosafety Testing to Gene Therapy Products. Genetic Engineering & Biotechnology News, 2021.
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