如何降低“高风险”宿主细胞蛋白带来的风险
本文节选自“How To Mitigate The Risks Posed By "High‐Risk" Host Cell Proteins.”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
宿主细胞蛋白(HCP)是工艺相关杂质，可能与生物制药产品共纯化。其中一些会导致不小的问题，可能被认为是高风险的，包括那些具有免疫原性、生物活性或酶活性的，可能会降解制剂中使用的产品分子或赋形剂。有些已经被证明很难通过纯化去除。
目前已知的HCP直接影响患者安全的案例很少，那么生物制药行业为什么要担心这些高风险HCP呢?我们可以采取什么方法来了解它们共纯化的起源，并解决这些高风险的HCP?
为了回答这些问题，BioPhorum开发团队 (BPDG) HCP工作组在其26家公司团队中发起了一项合作，围绕高风险HCP建立行业联盟。研究结果发表于名为“’High‐risk’ host cell proteins(HCPs): A multi‐company collaborative view”的文章中（点击左下角“阅读原文”，查看链接），本文对其进行了总结。
HCP工作组建立在之前的跨行业小组基础之上，这些小组对评估HCP杂质以及开发对监管机构要求的共同理解提出了建议。
一个子团队还进行了文献搜索，以了解高风险HCP的影响，并讨论成员公司的经验，其重点是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产的生物药物，并通过Protein A亲和柱以及额外的精纯步骤进行的纯化。
下游工艺中常见的HCP
CHO表达系统是生物制药生产中最常见的哺乳动物系统之一，因为它能够产生具有与人类相似的翻译后修饰的复杂蛋白质。目前已经确认了6000多种CHO HCP。
下游工艺通常包括Protein A亲和纯化，以及进一步去除聚体、电荷异构体、HCP和宿主细胞DNA的额外精纯步骤。针对ProteinA层析后的HCP情况进行的文献检索显示，在生物制药行业中发现了许多相同的HCP。尽管CHO细胞系、上游工艺或下游工艺存在差异，但鉴定出的HCP却相似。
研究小组从已发表的文献中总结了这些常见HCP的列表，可用于对照在不同工艺步骤中发现的HCP。这些都在BioPhorum文章的表格中完整列出，并提供了分子量、pI、氨基酸的数量，以及每个蛋白质与Uniprot数据库的直接链接。参见表1中的摘录。
表1：在不同工艺步骤中发现的常见HCP的综合列表 (仅摘录)
CHO蛋白质 | 分子量（kDa） | pI | UniProt 登录号 | 氨基酸数量 |
40S核糖体蛋白SA | 19.7 | 9.4 | G3HQX0 | 179 |
60S酸性核糖体蛋白P0 | 30.6 | 8.9 | G3HKG9 | 280 |
78 kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78；BiP) | 72.4 | 5.1 | G3I8R9 | 654 |
胞质肌动蛋白1 (ACTB) | 41.7 | 5.2 | P48975 | 375 |
α-烯醇酶（2-磷酸-D-甘油酸酯水解酶） | 15.5 | 5.0 | G3I0W1 | 139 |
BioPhorum的HCP可搜索数据库将继续更新常见的HCP及其特征(见表2)。不同HCP的身份可能对公司在开发下游工艺或优化现有纯化平台时有所帮助。
表2：常见HCP数据库摘录 – 仅组织蛋白酶CHO
CHO蛋白质 | UniProt 登录号 | 分子量（kDa） | pI | 氨基酸数量 |
组织蛋白酶B (CatB) | G3H0L9 | 37.5 | 5.7 | 339 |
组织蛋白酶D (CatD) | G3I4W7 | 44.1 | 6.5 | 408 |
组织蛋白酶E (CatE) | G3HAY9 | 42.2 | 4.7 | 388 |
组织蛋白酶L (CatL) | G3INC5 | 37.3 | 6.8 | 333 |
组织蛋白酶Z (CatZ) | Q9EPP7 | 34 | 7.5 | 306 |
HCP的分类
将可能导致问题的HCP归类为免疫原性高风险或低风险是很困难的。风险取决于许多因素，包括药物适应证、给药途径、给药频率和单位给药剂量的HCP量。
将问题性HCP归类为高风险的方法可基于HCP与产品共纯化的能力，其在下游工艺中的出现频率，其修饰或降解药物和/或赋形剂的能力，以及其免疫原性的潜力。
利用这种方法，HCP可以根据其潜在影响，分为四大类：产品质量、制剂、在人体中的直接生物学功能和免疫原性。通过HCP工作组广泛的文献搜索和工作经验，我们编制了一份高风险HCP清单，并根据它们的影响进行了分类 (列于BioPhorum所发表文章以及数据库的表格中)。
HCP工作组调查结果
经过全面的文献检索以及BPDG团队讨论，对团队进行了调研，以了解关于有问题或高风险HCP的成员公司的集体经验。主要调查结果摘要如下：
69%的公司表示，他们在药品生产过程中遇到过单个HCP的问题。 磷脂酶B‐样2是鉴定/检测和检测后清除反应最高的HCP。其它被鉴定的HCP包括脂蛋白脂肪酶、组织蛋白酶 (D、B和L)和溶酶体磷脂酶A2。大多数受访者表示，他们能够证明出这些HCP的清除情况。 大多数公司使用HCP特异性的质谱(MS)或酶联免疫吸附法(ELISA)来识别和测量单个HCP。较少的受访者使用酶/活性分析，只有一人表示使用凝胶切除后再用液相色谱-质谱分析。 大多数受访者使用一种或多种HCP ELISA方法进行释放检测，定量药物中的总HCP，少数使用MS定量、gyros、和meso scale discovery。 大多数受访者使用MS进行工艺开发支持；也有人将其用于临床和非临床原料药/药品样品。此外，64%的公司使用相对定量，其余使用绝对定量。 67%的受访者在分析前没有对HCP进行富集，17%进行了富集，其余使用沉淀。在消解方法上，13家公司使用胰蛋白酶，4家公司使用胰蛋白酶+赖氨酸C。 45%的公司表示，他们没有收到关于总HCP和单个HCP分析测试策略的监管反馈；36%的人说他们有。其余的人说，作为监管反馈的一部分，要求2D覆盖。
对行业的建议
在鉴定的HCP及其对工艺或患者的影响之间建立联系可能是具有挑战性的。因此，行业必须建立一个全面的分析策略，以适当地检测已知的HCP杂质，如果确定为高风险，则制定控制策略来监测和/或消除这些杂质。为达致上述目标而提出的建议如下：
开发总HCP免疫分析所需的关键试剂应该小心制备和表征。 针对工艺特异性HCP的关键抗体试剂应使用额外的正交方法进行评估，如2D凝胶/western和/或抗体亲和提取，然后MS。 总HCP ELISA应常规进行，以确定工艺样品中的HCP水平。 建议采用正交法和/或单独的HCP检测方法，以确保产品纯度。 如果单个HCP被鉴定并被认为具有潜在高风险：
为了更好地了解HCP水平及其潜在影响，可能需要开发一种监测已知杂质的特异性免疫分析方法或靶向MS分析方法。 如果鉴定出的杂质具有酶活性，则可以开发活性分析来指导工艺和产品开发，以监测、去除和/或灭活蛋白质。 免疫原性评估可以通过计算机（在硅）方法进行，如果计算机预测表明免疫原性风险高，则进行体外比较免疫原性评估。 毒理学输入在评估临床风险中可能有不小的价值。
HCP的检测、定量以及从最终的生物治疗药物工艺中去除可能是复杂的。Biophorum的高风险或问题性HCP列表可以为开发CHO细胞生物治疗药物的公司提供资源。它将它们分为四个主要类别，主要根据其对产品质量的影响、制剂、在人体中的直接生物学功能以及免疫原性(见表3)。如果在工艺过程中鉴定了一种在高风险列表中的HCP，企业应该遵循建议的行动，进行风险评估，并建立HCP控制策略。
表3：根据其影响对高风险HCP进行分类(仅摘录)
蛋白质名称 | 功能 | 影响 | 影响类型 | 所选参考文献 |
78 kDa葡萄糖调节蛋白(GRP78；BiP) | 内质网管腔的蛋白质折叠和质量控制 | 药物质量 | 药物聚集 | Farrell et al., 2015; Liu et al., 2019; Valente et al., 2015 |
α - 烯醇酶 | 催化2‐磷酸甘油酸脱水成磷酸烯醇丙酮酸 | 药物质量 | 药物修饰 | Valente et al., 2015; Zhang et al., 2014 |
膜联蛋白A5 (ANXA5) | 与磷脂具有高亲和力，可作为细胞凋亡的标志物 | 免疫原性 | 免疫原性反应 | Fukuda et al., 2019; Gilgunn & Bones, 2018 |
C‐X‐C模体趋化因子3 (CXCL3) | 具有潜在致癌特性的细胞因子 | 在人体中的生物学功能 | 免疫原性反应 | Gilgunn & Bones, 2018; Gilgunn et al., 2019 |
羧酸酯酶(CEB) | 催化裂解含酯或酰胺的底物形成醇和羧酸 | 制剂 | 聚山梨醇酯的降解 | McShan et al., 2016; Zhang et al., 2020 |
每家公司在产品和工艺开发过程中可能会遇到不同的情况，必须在各个案例的基础上进行HCP风险评估。我们希望这次合作将指导行业有针对性进行高风险HCP的表征，并主动降低生物制品中这些HCP带来的风险。
原文：BioPhorum, How To Mitigate The Risks Posed By "High‐Risk" Host Cell Proteins. BioProcess Online, 2021.
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