重新定义细胞/基因治疗污染控制
本文节选自来自Ori Biotech的研究人员发表的文章《Redefining Contamination Control for CGTs》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
迄今为止，行业仍很难检测和分类细胞/基因疗法(CGT)中的污染物。CGT疗法中发现的主要污染物包括，但不限于，细菌、支原体、病毒、多肽/蛋白质、细胞因子、生长因子、抗生素、磁珠、血清、死细胞、不需要的哺乳动物细胞、非活性颗粒、内毒素、热原和生物负荷。根据PLOSOne的一篇文章显示，围绕许多潜在污染物的问题是缺乏标准，这很大程度上是由于这些正在被使用的成分的全新特性。此外，CGT标准的缺乏在于行业尚未完全成熟，以前的药物通常使用终端除菌，作为一种非常成功的方法来降低污染风险，特别是在制药行业。这就给CGT开发者留下了负担或潜在的机会，让他们在对各自治疗药物的了解和风险的基础上开发自己的分析方法。因此，在治疗性产品生产后检测终产品中的任何污染会导致较高的生产失败率，增加生产成本。
不幸的是，在CGT中，由于产品是“活的”，终产品不能采用灭菌方法。过滤、加热、辐照或化学灭菌会使产品失效。因此，生产需要高度控制的环境，以限制污染风险。然而，即使采取了所有这些控制措施，仍然会有很高的污染机会，包括来自进入洁净室的人员和物料。由于存在这种风险，监管机构坚持使用《21联邦法规第210和211部分》（21 Code of Federal Regulations Parts 210 and 211）中规定的GMP标准。而即使有了GMP，也有很多导致污染的原因，因此，由于使用受污染产品的潜在致命性后果，仍然期望对每个批次进行终产品的污染检测。
也许CGT行业中用于污染物分析的最大障碍直接与放行分析的时间和有限的通量有关，其次是它们高度的手动操作和费力特性。标准参考技术(例如，美国药典[USP] <71> 14天无菌性检测，USP<63> 28天支原体检测)是为批次体量较大且允许时间自由的制药行业设计的。虽然存在一些针对无菌性的快速微生物方法(RMM)(BACTEC和BacT/ALERT)，但检测可能仍需要5到7天。此外，RMM需要广泛的验证。此外，标准参考技术通常开发用于任何活细胞被认为是污染物的产品。而对于CGT，最终的产品是活的产物，但是需要对所需的活细胞(如T细胞和造血细胞)和不需要的活细胞(如细菌和真菌)进行表征和区分。特别是对于自体治疗，如嵌合抗原受体T细胞(CAR - T)，有必要对生产的每一个批次进行检测，而每一个批次的体积都有限，而更关键的是将治疗性产品送回患者的时间。
BioPhorum运营小组发表的一篇论文强调，对生物制药终端用户的调查显示，对当前GMP放行检测最不满的一个领域之一，是获得结果的时间。此外，为了向等待治疗的患者交付治疗性产品，并行规模扩展以拥有许多不同且独特的批次产品至关重要。对于CGT行业来说，克服当前这一障碍最有可能的途径是通过技术创新。
除了微生物污染外，非活性颗粒可能从任何数量的原材料脱落或作为生产副产品存在于原材料中。因此，颗粒鉴别必须纳入开发工作，以为测试方法和时间提供信息。对于注射性生物制剂，标准的非活性颗粒检测是通过光学显微镜实现的，USP<788>，尽管这项技术非常依赖手动操作，且繁琐和主观。此外，所有治疗性产品本身都是由颗粒(如细胞和蛋白质簇)形成的。因此，从治疗性产品中确定不需要的颗粒仍然是一个挑战。一旦检测到颗粒，可以通过扫描电镜(SEM)和/或傅里叶变换红外光谱来完成材料的鉴别 - 这两种破坏性方法都需要熟练的分析人员。在自体移植治疗中，这些破坏性的试验可能导致患者无法接受治疗。
检测治疗产品中的污染物
许多可能的污染物缺乏标准，这也为技术的新进展在确保治疗产品的安全性方面发挥重要作用提供了机会。随着分析力量和能力的提高，越来越多的人开始关注应用新技术来解决这个质量控制瓶颈。一种合理的方法是通过分子分析方法进行微生物污染检测。大多数此类方法采用聚合酶链反应(PCR)方法，检测可以实现较高水平的灵敏度以及相对较短的分析时间。PCR分析并非没有限制，此类分析中较高水平的实验室内和实验室间差异性对于可比性分析构成了一定的问题。数字微滴聚合酶链反应(ddPCR)也是CGT分析中受到日益浓厚的兴趣的一种扩展技术。ddPCR在检测病原体负荷方面具有更高的灵敏度和准确性，因此比传统的RT- qPCR方法更具优势。
值得注意的一个领域是对用于污染物追溯的下一代测序(NGS)的关注。细胞和基因治疗弹射器（CGTC）与一家主要的细胞治疗开发商及技术提供商合作，致力于为CGT开发新型快速无菌检测方法，这是一个多年的项目，其主要集中在目标DNA的测序以及高灵敏度数字PCR的使用上，后者能够检测单个拷贝数的污染物，理想情况下也能区分活的和死的微生物。在发表于BioRxiv的一篇文章中，专家们报告了一种基于NGS的无菌分析方法的开发及其在哺乳动物培养样品检测中的应用。
除了以上所述的传统方法外，人们还非常希望缩短整体的检测时间，降低必要的取样负担，并将质量源于设计(QbD)的原则应用于污染物检测，这样，就可以在整个CGT生产过程中更定期地进行监测，而不是等待终产品的检测结果。技术的进步为分析方法的开发提供了新的方法。其中之一就是微流控，近几十年来，微流控在诊断平台中的控制和应用方面显示出了令人难以置信的多功能性。发表于SLAS Technology的一篇文章介绍了一种用于微生物快速筛选的微流控分离和检测系统，可直接应用于哺乳动物细胞样品。
就非活性颗粒而言，如果能够进行开发工作，以了解生产过程中典型颗粒物的来源，那么理论上，非活性颗粒物的检测可以转移到过程中，以替代或提示终产品检测。流动成像可能是一种可行的方法，尽管根据细胞产品类型，可能需要产品特异性的算法。另外，可以对当前的细胞计数仪或流式细胞仪进行配置，以区分颗粒和细胞。
尽管所讨论的每一种污染物鉴别方法都有望简化和降低质量控制(QC)负担，但在CGT领域实现这些分析能力仍然是一个挑战。当然，在商业生产层面上，仍然严重依赖于那些无法满足行业日益增长的需求的方法。这些疗法有非常独特的检测挑战，而且获得结果的时间尤其关键。将检测向上游移动的能力是一种通过在线传感器来提供实时检测以缓解时间延迟的方法 - 这是另一项迄今为止在技术上不可能完全实现的进步。围绕这些方法，自动化的使用可以大大缩短CFR/USP药典检测方法的时间，并增强任何即将到来的技术。开发中的技术以及新技术的应用也促进了巨大的进步，随着新技术进入市场，可能会开发出更适合CGT行业的具体解决方案。然而，在评估用于QC放行的新分析方法时，这些都不是小因素。
成功检测终产品中污染物的能力对于确保安全的产品到达患者是至关重要的，但它感觉更像是“绷带”而不是解决方案。QbD的主要目标是降低整个过程中污染物的可能性，而不是对终产品进行评估，尽管在CGT中这两种情况都很可能会出现。
尽可能降低治疗产品中的污染物
对污染物的检测可确保药品的安全性，但任何阳性结果(无论真假)都会导致生产失败以及无法治疗患者。颠倒这个模型意味着，我们需要设计这样一个行业，使污染在生产开始之前就降到最低。从开放式生产系统到封闭平台的不断增长的转变彻底改变了这种方法。按照定义，通过转移到一个(成功的)完全封闭的系统，将确保治疗性产品不暴露于环境当中，从而消除最大的污染源之一。然而，这只是转向封闭式系统的一个驱动因素，此外，由于对工厂等级要求较低，可降低环境成本，而且封闭式系统更容易实现自动化。由于这个原因，封闭式系统和自动化系统常常结合使用。但这并不能解决其它污染问题，如原材料或耗材。
为此，CGT开发商需要与供应商紧密合作，以满足质量要求。无菌性已经而且必须是极其必要的。但是应该定义期待供应商保证的其它CMA(非活性颗粒、热原、生物负荷规范)。目前治疗性产品在成本、时间和准确性的负担在原材料上更容易分担，其通常是大批量生产的，分散了许多产品的检测成本，并延长了稳定性时间，以避免供应方面的挑战。只有要求原材料供应商做到这一点，才能进一步降低端到端的污染风险。
即使有了全自动化、工艺封闭以及针对原材料的污染物规范，也始终需要进一步降低整个生产过程中的任何污染风险。污染物检测的需求仍然存在，但将检测转移到上游可以缓解CGT生产目前面临的一些挑战。分析方法将继续取得巨大进步。通过加强控制和实施QbD原则，可以努力减少产品放行分析检测的总体负担。对于所需的质量控制结果，可以寻求更快、更高效、更廉价的技术，这些技术可以在很大程度上实现自动化，并消除大量高技能劳动力的成本。此外，通过采用新的检测方法，可能会出现具有更高水平的灵敏度和准确性的污染物检测解决方案，这最终将提高产品安全性的保证 - 最终也会提高患者的安全性。
原文：D. Smith, C.LeBlon, S. Shapka, “Redefining Contamination Control for CGTs,” BioPharmInternational 34 (11) 32–35 (2021).
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