AAV细胞培养液的收获和澄清
本文节选自“Moving from the Bench Towards a Large Scale, Industrial Platform Process for Adeno-Associated Viral Vector Purification”，更多详细内容，请参考原文。
AAV生产后，纯化的第一步是收获。收获的主要功能是去除原料液流中的固体颗粒，以促进下游工艺处理。在去除固体颗粒之前，可以在生物反应器中进行细胞裂解和/或核酸内切酶处理步骤，这取决于AAV病毒颗粒被释放到培养基中的程度。
典型AAV下游工艺示意图。
早期对AAV载体的研究通常使用AAV2血清型，在这种血清型中，病毒颗粒释放进入培养基的量是有限的，需要裂解细胞才能得到产物。在开始对其它血清型的研究后，研究人员发现，AAV释放进入培养基的程度与血清型高度相关，除AAV2和AAV5外，大多数AAV可在一定程度上释放进入培养基中。此外，AAV进入培养基的运输有赖于表达条件，如中碱性pH或低血清水平，以及感染/转染后的时间。
据一篇报导称，AAV8在培养基中的载体量大于85%，而AAV2细胞外载体量小于20% 。研究发现，特定血清型对肝素结合的亲和力（其往常被用促进病毒进入细胞，并可能因此有助于确定载体趋向性），在运输AAV进入培养基或细胞的效率中发挥了重要作用。含有肝素结合残基的血清型（每种血清型具有各自的特异性，且不保守），显示保留在细胞颗粒部分的载体比例更高，可能是由于肝素结合颗粒与细胞高度关联，而没有被释放到培养基中。
虽然选择在培养基中表达较高的AAV血清型可能是有益的，但载体的选择取决于每种血清型的趋向性。例如，AAV8和AAV9是靶向肝脏和骨骼肌组织的最佳载体，而AAV2常用于靶向肾脏。尽管可以开发仅针对细胞外培养基的工艺，但通常会在生产过程中加入细胞裂解步骤，以最大限度地提高AAV的生产滴度，特别是需要建立适用于不同血清型的平台化工艺时。对于大规模生产，要考虑的是如何一方面最大限度地提高收获产量，但同时降低由于宿主细胞裂解而随之产生的杂质负荷的增加。为达到所需的理想杂质水平，杂质负荷量的增加将可能导致纯化收率的降低，因为对杂质去除表现出高选择性的条件通常与收率呈反比关系。换句话说，需要对整体工艺收率进行全面的分析。
细胞裂解可以通过化学方法(例如去污剂剂或高渗溶液)或物理方法(例如多次冻融循环、微流化或超声)进行。虽然物理裂解方法在实验室规模中很常见，也很有效，但这些方法通常需要专门的设备，且往往对与其规模有关的参数没有完全了解和表征，难以放大到cGMP工厂使用。这导致行业一般偏向于使用化学裂解方法来扩大规模。
Triton X-100是一种常用的去污剂，其被证明是有效的，且成本不高。去污剂的使用与浓度和时间有关，据报道，TritonX-100浓度在0.1% (2小时，37℃)和0.5%(1小时)之间，足以导致细胞破裂和AAV释放。虽然Triton被广泛用于细胞裂解，但其降解产物对环境的影响以及其不久会被纳入欧盟禁止物质的化学品注册、评价、授权和限制清单，预计将限制其使用。因此，替代药物已经并将继续被探索。例如，Tween®20 与Triton X-100 相比，表现出了相当的合适性能，尽管仍存在对下游层析单元操作影响的潜在担忧。使用酸性缓冲液进行细胞裂解，如pH为4.2的柠檬酸盐，也已被研究，可能可以作为一种替代型去污剂，减轻对下游单元操作的影响，并消除验证去污剂清除的需要。柠檬酸复合二价离子和低pH值可能可触发病毒衣壳蛋白蛋白酶活性，这有助于AAV载体的释放。此外，使用柠檬酸等酸性缓冲液裂解细胞可以促进AAV释放，且污染更少。
在细胞裂解步骤后，通常会进行酶处理步骤，以降解释放的核酸，随后再进行后续的纯化步骤。通过将核酸降解成更小的片段，得到的溶液更均匀，粘性更小，通常可以获得更高的可过滤性，此外还可以降低在最终产品中携带全长致癌基因的风险。其中一种内切酶，Benzonase®，在工业应用中被广泛使用。据报道，在37℃、pH 8.0-9.2、酶活性所需的Mg2+含量较低(1-2mM)时，其工作效果最佳。文献中经常报道37℃、30 min条件下的浓度为50 U/ml 。由于Benzonase受盐含量增加的负面影响，所以可以使用盐激活核酸酶(SAN-HQ, Arcticzymes)作为替代，因其在较高NaCl水平下(0.5M NaCl)活性提高，而在AAV纯化过程中，通常使用高水平的NaCl来提高回收率。在cGMP生产中使用酶处理的两个重要的注意事项是(i)需要进行因原材料而引入传染性海绵状脑病(TSE)和病毒的风险评估，在理想情况下，核酸内切酶的生产需无动物源性，以及(ii)需要有合适的方法，以证明最终药物产物中引入的酶已被清除。
在细胞裂解和酶处理(如进行)后，收获的物料将是高度混浊的溶液，其中包括AAV颗粒以及与工艺相关的杂质(如DNA、蛋白质、培养基成分和细胞碎片)。工艺相关杂质的去除通常通过离心和/或过滤的结合来进行，目的是在随后的层析单元操作之前，使杂质和颗粒的挑战最小化。优化的收获步骤将有助于提高产量，还可能可提高层析填料的使用寿命，并降低对层析介质所需严格清洗方案的要求。离心和膜过滤在实验室规模下都很方便，但对于50-2000 L料液的澄清，一次性使用的深层过滤是大部分情况下的首选方法，以尽可能降低硬件设备投入成本，并便于规模放大。虽然不锈钢离心机也适用于大规模生产，但其可清洁性和操作人员因气溶胶形成而面临的暴露风险是需要考虑的关键因素。另外，尽管市面上存在一次性使用离心设备，如Ksep和Unifuge，但两者规模选择均有限，并可能增加开发时间。一次性使用技术降低了设备的初始投资成本，减少了用水，并降低了交叉污染的风险。此外，这些技术通过降低清洗和清洗验证的需要，而降低产品轮转时间，这允许在给定的时间框架内增加生产次数或缩短多个程序之间的时间。这可增加整个工厂的利用率和灵活性。此外，由于上述原因，大多数合同生产组织（CDMO）可能只有可进行一次性使用操作的设备。
虽然市面上存在很多过滤器选择，但生物制药行业(包括AAV生产)主要使用深层过滤器，因其固体容量更大。深度过滤器有各种孔径范围，可以是传统的品种（其中包括纤维素，硅藻土(DE)和树脂粘合剂）或合成材料（如玻璃或聚丙烯纤维）。相比合成性过滤器，使用天然成分（如纤维素和硅藻土）的传统过滤器可能会有性能差异，且可能导致溶出/析出成分，如β-葡聚糖已被证实会导致鲎试剂试验出现假阳性，如果不控制使用通路阻滞剂，如羧甲基凝乳酮。对于深层过滤器，蛋白质结合的倾向应该被认为是组成部分(助滤剂、过滤介质、树脂粘合剂)对蛋白质吸附的影响。例如，一家供应商(3M)使用了两种不同的树脂粘合剂，Zeta Plus ZB和Zeta Plus SP分别具有强阴离子交换性能和弱阴离子交换性能。AAV工艺的最佳过滤器取决于上游工艺和过滤前的处理条件，也取决于血清型，这是因为在深层过滤器上AAV有潜在的吸附作用。通过优化的AAV收获工艺，深层过滤器处理量可超过200 L/m2，收率可达75%，从而使工艺更易于放大到生产规模。
对于现有深层过滤系统的工业应用，如STAX mAx澄清平台、Millistak+ Pod深层过滤系统或Zeta Plus™系统，存在的一个问题是，在不使操作人员暴露于工艺流体的情况下，无法将系统拆开。虽然AAV本身是一种1级风险的生物，但由于存在整合的DNA，所以还是应尽量避免操作员暴露于AAV病毒载体。此外，对于使用辅助病毒进行生产的系统(如腺病毒、疱疹病毒)，操作人员可能在辅助病毒灭活之前暴露于病毒。为了减少操作人员暴露的风险，可在拆卸前进行化学处理。建议进行风险评估，以确定相关整合基因或生产系统是否需要额外的考量，以确保操作人员的安全。
原文：B.Adams, H.Bak, A.D.Tustian, Moving from the Bench Towards a Large Scale, Industrial Platform Process for Adeno-Associated Viral Vector Purification. 2020, Biotechnology & Bioengineering, https://doi.org/10.1002/bit.27472.
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